1899年，在沈阳嗣父处的陈独秀得悉母亲病重的消息，与长兄匆匆返乡。途中，遭遇“红胡子”，准备劫财害命。抢匪得知陈独秀是陈衍庶之子，马上归还财物，并护送他们入关。传说是因为陈衍庶任奉天省新民府知府时，红胡子张作霖曾被捕判死刑，陈衍庶将其救下，并将其招安。

陈独秀在东北目睹八国联军侵略我国，后来回忆：“前年金州有俄兵奸淫妇女而且杀之，地方老绅率村民二百人向俄官理论，非徒置之不理，且用兵将二百人全行击毙。俄官设验疫所于牛庄，纳多金者则免，否则虽无病者亦置黑狱中，非纳贿不效。其无钱而囚死狱中者，时有所闻。”

1902年冬，留学日本的陈独秀参加了留日学生中最早的革命团体“青年会”，该会“以民族主义为宗旨，以破坏主义为目的”。翌年3月31日，因学监姚煜阻挠学生学习军事，且诱奸同事钱午的侍妾，引起众学生的公愤，陈独秀、邹容、张继、翁浩、王孝缜五人夜间闯入姚宅，声言要割掉他的脑袋。姚哀求宽大，邹容说：“纵饶汝头，不饶汝发。”于是由张继抱腰，邹容捧头，陈独秀挥剪，割发代首，事后又将姚的发辫悬挂在留学生会馆，旁书“南洋学监、留学生公敌姚某某辫”。后来，姚与清政府驻日公使勾结日方，要抓捕陈等人，陈独秀、邹容、张继三人于4月间被迫返国。

5月17日，陈独秀等人在安庆“藏书楼”发起皖省首次拒俄大会。这天虽大雨滂沱，仍有约300余人到会，因书楼甚窄，参会者大多立在门外听讲演。陈独秀也发表演说，谈及当年在东北耳闻目睹沙俄欺侮乃至残杀东北父老乡亲的种种惨状，座中无不欷嘘。陈还大骂某些人“平日口谈忠孝，斥人为叛逆，一遇国难，则置之不问，绝不肯兴办公益之事，唯思积款于外国银行，心中怀有执顺民旗降敌一大保身妙策，是为国贼，是为逆党。是等国贼、逆党不杀尽，国终必亡”。陈的言论引起当局的震惊，两江总督端方下令缉拿，陈独秀遂避祸上海。

1904年，陈独秀受章士钊邀请，到上海由杨笃生监誓，加入了军国民教育会暗杀团。在此后的1个多月中，陈“天天从杨笃生、钟宪鬯试验炸药”，并与蔡元培结识。之后，由于黄兴在长沙事泄失败，万福华刺杀王之春未遂，上海的暗杀机关受到牵连，在上海的革命党人被迫星散逃匿，陈也回到了芜湖。

清廷拟派五大臣出洋考察，杨笃生作为翻译随行，便乘机安排吴樾伺机暗杀。事前，吴樾回原籍安排家事，路过芜湖，曾与陈独秀、赵声“密计于芜湖科学（图书）社小楼上”。议遂定，临歧置酒，相与慷慨悲歌，以壮其行。吴樾到北京伏击五大臣乘坐的火车，因人多拥挤，车身震动，怀中弹发，载泽、绍英二人受伤，出洋考察不得不暂缓启程。而吴樾亦壮烈牺牲，时年26岁。消息传来，陈独秀用暗语致函张啸岑道：“北京店事，想是吴兄主持开张。关于吴兄一切，务速详告。”

在陈独秀的努力下，其任教的芜湖安徽公学成为安徽革命运动的中心。该校中，除陈独秀外，有刘师培、陶成章、柏文蔚、苏曼殊、谢无量等，吸引了大量青年，轰动整个芜湖社会。同年暑假，陈独秀为了联络皖省革命志士，一肩行李，一把雨伞，与柏文蔚等足迹遍及江淮南北，先后到达怀远、蚌埠、蒙城、涡阳、亳州、太和、阜阳、正阳关和寿州等地，遍访江湖侠士，物色志同道合的革命人士。

1905年，陈独秀、柏文蔚等在芜湖成立岳王会，陈任会长，取名岳王会是取岳飞精忠报国的精神。参加者除安徽公学中的优秀学生外，还有武备学堂的部分军人，整个组织大概有30多人。岳王会第一次开会时，会员一起烧香宣读誓约。

在日本时，陈独秀虽与同盟会成员章太炎、张继、刘师培过从甚密，也曾加入革命党的暗杀团体，但一直没有加入同盟会。傅斯年回忆，陈曾表示，同盟会除孙中山、廖仲恺和朱执信外，大都是些平庸人才，不足与谋，也不足与言，甚至认为同盟会是一堆全躯保妻子之徒，绝对干不了革命。

武昌起义爆发后，在浙江陆军小学任教的陈独秀起草了多篇革命檄文，到处张贴。其中一篇被光复会陆军小学队长周亚卫和排长高文蔚张贴在城内鼓楼的门旁，“省垣官吏闻之悚然”。

“二次革命”爆发后，安徽都督柏文蔚宠信的部下胡万泰叛变，率兵攻打都督府，柏被迫离皖，逃至南京，任都督府秘书长的陈独秀则逃亡到芜湖。芜湖驻军龚振鹏在芜湖每日枪决民众，杀人无度，陈独秀十分愤怒，和师长袁家声闯进龚的指挥部，痛斥其非。龚振鹏下令将陈独秀、袁家声绑了起来，并威胁要毙了陈独秀。陈从容催促道：“要枪决就快点罢！”旅长张子刚得知消息后，连忙带领手枪卫士前去营救。刘文典等人则速派人送信给在南京的柏文蔚，请他火速前来营救。柏忙到芜湖，与龚握手言和，陈独秀方始得救。

“二次革命”失败后，安徽督军倪嗣冲指派统领马联甲带人查抄陈家。当时，陈独秀嗣父陈衍庶去世不过百日，棺木还暂厝在家中，嗣母谢氏时正患病，遭此变故，病情愈发严重。陈独秀长子延年、次子乔年兄弟跳墙逃走。马联甲抢掠走陈昔凡的古玩字画，并将陈独秀的侄子陈永年带走。后来发现陈永年确系陈独秀侄子，才释放了陈永年。是年10月21日，倪嗣冲发出通告，通缉“二次革命”皖省重要革命党人，陈独秀冠之榜首。在上海避祸的陈独秀听说后，愤愤说道：“以我之气，恨不得食其人。”